Criopreservação de tecido testicular de cães (Canis lupus familiaris) utilizando sistemas fechados de vitrificação.
Gabriela Linhares Leite
UFERSA
Lilian Leal Dantas
UFERSA
Romário Parente dos Santos
UFERSA
Andréia Maria da Silva
Alexandre Rodrigues Silva
UFERSA
Palavras-chave: Cães, Criopreservação, OTC, Criotubos, Histologia
Resumo
Os cães desempenham papel relevante nas atividades humanas e nos núcleos familiares, tornando essencial sua manutenção reprodutiva e a conservação genética. A criopreservação de tecido gonadal é uma estratégia aplicável a cães pets ou de alto valor zootécnico. Nesse contexto, objetivou-se avaliar os impactos da vitrificação por Ovaryan Tissue Criosystem (OTC) e criotubos em fragmentos testiculares. Foram utilizados 5 pares de testículos obtidos por orquiectomia eletiva, fragmentados em 3 mm³ e divididos em grupo fresco e criopreservados. Inicialmente, as amostras foram imersas por 10 min em solução de equilíbrio [Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), 0,25M de sacarose, 10% de soro fetal bovino, 1,4M de dimetilsulfóxido e etilenoglicol] e 5 min em solução de vitrificação com o dobro de sacarose e crioprotetores, sendo seladas em OTC ou criotubos. Após 1 semana, foram aquecidas a 37°C por 1 min e submetidas à remoção dos crioprotetores em DMEM com sacarose decrescente (5M, 2,5M e 0M). Fragmentos dos grupos fresco e vitrificado foram avaliados quanto a viabilidade celular em microscopia de fluorescência utilizando os fluorocromos iodeto de propídio e Hoechst 33342. Para avaliação do nível de apoptose celular foram utilizados o brometo de etídio e laranja de acridina. Adicionalmente, foi realizada a avaliação da morfologia dos túbulos seminíferos, fragmentos foram processados para histologia, corados com hematoxilina-eosina e avaliados em microscopia de luz quanto à morfologia, sendo classificados em escores de 0 (pior) a 3 (melhor). Os dados foram expressos como média e erro padrão, e comparados pelos testes de Kruskal-Wallis e Dunn (P < 0,05). Quanto aos resultados, a viabilidade celular reduziu do tecido fresco (76%) para os criopreservados por OTC (46,20%) e criotubos (31,60%), sem diferença significativa entre estes, embora com valores numericamente maiores para OTC. A apoptose não diferiu entre os grupos AP (apoptose precoce), AT (apoptose tardia) e o controle fresco, enquanto células necróticas foram observadas apenas nos vitrificados (10,40% OTC; 25,80% criotubos). Na avaliação morfológica dos túbulos seminíferos, os criopreservados apresentaram menores escores que o tecido fresco (P < 0,05). A estrutura tubular foi de 2,26 ± 0,04 no fresco, 1,65 ± 0,04 no OTC e 1,42 ± 0,04 nos criotubos. A vacuolização (2,32 ± 0,04; 1,96 ± 0,04; 1,88 ± 0,04) e a perda de células tubulares (2,48 ± 0,04; 1,96 ± 0,03; 1,86 ± 0,03) também foram reduzidas após a criopreservação. Apesar dos índices de ruptura da membrana basal permanecerem próximos ao controle (2,92 ± 0,02), os grupos criopreservados diferiram estatisticamente (2,54 ± 0,04 OTC; 2,55 ± 0,04 criotubos). Conclui-se que OTC e criotubos são alternativas viáveis para criopreservação testicular em cães, sendo necessários ajustes nos protocolos para maior preservação estrutural e celular.