Construção de vetor de clonagem e expressão de gene de Corynebacterium pseudotuberculosis para a imunoprofilaxia contra a Linfadenite Caseosa
Lúcia Larissa de Lima Andrade
UFERSA
Pablo Leandro Filgueira Feitosa
Thiago Vinícius Santos e Alves
Bárbara Monique de Freitas Vasconcelos
Francisco Silvestre Brilhante Bezerra
Palavras-chave: Clonagem molecular, copC, pAE, Antígeno recombinante, Vacina
Resumo
Corynebacterium pseudotuberculosis é o agente etiológico da linfadenite caseosa (LC), enfermidade crônica que afeta principalmente pequenos ruminantes e gera perdas econômicas na ovinocaprinocultura em escala global. As abordagens terapêuticas convencionais para a LC apresentam eficiência limitada, enquanto as vacinas disponíveis no mercado possuem eficácia variável, podendo não conferir total proteção. Assim, o desenvolvimento de vacinas recombinantes tornou-se uma alternativa na profilaxia da LC e o gene copC de C. pseudotuberculosis apresentou-se como alvo vacinal promissor em estudos in silico (Araújo et al., Gene, 702:36-45, 2019) porém ainda não foi expresso e testado com objetivo vacinal. Assim, objetivou-se clonar o gene copC de C. pseudotuberculosis no vetor pAE visando expressão heteróloga futura e ensaios vacinais in vivo. O DNA genômico da cepa 1002 de C. pseudotuberculosis foi extraído utilizando o PureLink® Genomic DNA Mini Kit (Thermo Scientific). A amplificação do gene copC (Gene ID: 69459341) foi realizada através de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), com o uso de 50 ng do DNA genômico, 10 μM de cada primer (forward 5’TTACCATGGGGCTATTGTCGG3’ e reverse 5’TCTAAGCTTTTAACCTTTCTGTTTACGAG3’) e PCR Master Mix (2x) (ThermoFisher Scientific®) em um volume final de 50 μl. Para a definição da melhor temperatura de anelamento, utilizou-se um gradiente da temperatura entre 51 e 61 ºC (Tm = 56°C). Os amplicons foram visualizados em gel de agarose a 1%, utilizando o corante Blue Green (LCG Biotecnologia®), sob luz UV. O vetor pAE e os amplicons foram digeridos com as enzimas FastDigest® HindIII e NcoI (ThermoFisher Scientific®) e ligados com a enzima T4 DNA ligase (ThermoFisher Scientific®). Células eletrocompetentes de E. coli TOP10 foram transfectadas com o produto da ligação por meio de eletroporação. Os transformantes foram selecionados em ágar Luria-Bertani (LB) suplementado com ampicilina (100 μg/mL) e incubados a 37 °C por 16 horas. O screening de colônias foi realizado por lise rápida de colônia com fenol-clorofórmio (v/v) seguida de eletroforese em gel de agarose (0,8 %). Os possíveis clones recombinantes foram cultivados em caldo LB contendo ampicilina (100 μg/mL) a 37 °C sob agitação (140 rpm) por 16 horas, e o DNA plasmidial foi subsequentemente isolado com o PureLink™ Quick Plasmid Miniprep Kit (ThermoFisher Scientific®). A identidade da construção recombinante (pAE/copC) foi validada por PCR. Como resultados, a temperatura de anelamento de 52.7ºC resultou em amplificação mais eficiente, gerando uma banda de 556 kb. No screening foi possível observar bandas referentes ao DNA plasmidial em posições mais altas (acima de 2800 pb) que as bandas do pAE não recombinante, sugestivas de colônias recombinantes. Em tais colônias, confirmou-se a clonagem do gene copC no vetor pAE através de PCR dos plasmídeos extraídos, pela visualização das bandas do gene copC com tamanho de 556 kb em gel de agarose. Em conclusão, os resultados comprovaram o sucesso da clonagem molecular do gene copC em vetor pAE, estabelecendo a base para a expressão heteróloga da proteína recombinante e testes pré-clínicos visando o desenvolvimento de formulações vacinais contra a linfadenite caseosa.