Impacto do extrato de fumaça de cigarro no estroma ovariano cultivado in vitro
Victor Gabriel Freire de Gouveia
Universidade Federal Rural do Semi-Árido
Fabrícia Barroso Rodrigues
Rebeca Paulina Duarte Queiroz
Flavio Santos da Silva
Gerlane Modesto da Silva Balzani
Palavras-chave: Estroma, Extrato da Fumaça de Cigarro, Ovário, Automático
Resumo
A densidade de células estromais é um importante indicador da integridade tecidual e pode influenciar a foliculogênese por meio da mecanossensibilidade celular. Sua compreenção pode auxiliar na estimativa da reserva folicular ovariana e na otimização da manipulação in vitro de folículos pré-antrais. Contudo, o método tradicional de contagem celular é laborioso, demorado e subjetivo, limitando estudos que exigem a mensuração de muitas células. Atualmente, nosso laboratório investiga os efeitos da fumaça de cigarro sobre o tecido ovariano, reconhecida por causar alterações histomorfológicas e prejudicar a reprodução feminina, embora seus mecanismos ainda não sejam totalmente compreendidos. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a viabilidade e a precisão da metodologia automática, aliada à investigação do impacto de diferentes concentrações do extrato de fumaça de cigarro na densidade de células estromais. O tecido ovariano foi coletado de quatro cabras adultas em abatedouro local, lavado e transportado em antibiótico e solução salina a 4 °C. O extrato aquoso da fumaça de cigarro (EFC) foi preparado conforme protocolo adaptado de Gellner et al. (2016), utilizando um sistema de sucção que direcionava a fumaça através de solução salina. Fragmentos corticais ovarianos (3 × 3 × 1 mm) foram cultivados por sete dias em meio α-MEM+ isolado ou junto da adição do EFC, formando 3 grupos (controle, 2,5% e 5%). Após fixação e coloração, as amostras foram analisadas por microscopia óptica. A densidade estromal foi quantificada automaticamente pelo software ImageJ e validada manualmente. Os dados foram submetidos à análise estatística (ANOVA, Tukey, p < 0,05). Houve correlação significativa entre as contagens automática e manual das células estromais, embora a análise de Bland-Altman tenha revelado ausência de concordância entre os métodos. O sistema automático apresentou superestimação em imagens com baixa densidade celular e subestimação em áreas muito aglomeradas, mostrando melhor desempenho em imagens com 25 a 55 núcleos. Apesar disso, a forte correlação sugere que o método é sensível a variações reais na densidade celular. Na análise dos efeitos do extrato de fumaça de cigarro, não houve diferença significativa na densidade estromal entre os grupos, tanto pela análise automática quanto manual. Contudo, observou-se redução significativa no tamanho nuclear, possivelmente relacionada à apoptose dos fibroblastos. A ausência de alteração na densidade pode estar ligada ao tempo limitado de exposição, às concentrações empregadas ou ao método de coleta do extrato, que capturou apenas os componentes solúveis em água, reduzindo seu potencial tóxico. Foi apresentado um método automatizado para contagem de células estromais ovarianas, apresentando forte correlação com a contagem manual, embora sem plena concordância em todas as amostras, necessitando de ajustes no método. Não houve diferença na densidade celular entre os grupos, porém, exposições mais intensas ou prolongadas podem acarretar em mudanças desses resultados.