Construção de plasmídeo recombinante para expressão de antígeno de C. pseudotuberculosis com finalidade vacinal
Gabriela Rebouças
UFERSA
Ana Karolina Melo Oliveira Barros
UFERSA
Augusto César Silva Ribeiro
UFERSA
Pablo Leandro Filgueira Feitosa
UFERSA
Francisco Silvestre Brilhante Bezerra
UFERSA
Palavras-chave: Proteína recombinante, Clonagem molecular, YkuE, Linfadenite caseosa
Resumo
Na última década, o interesse pelo desenvolvimento de vacinas recombinantes contra a linfadenite caseosa (LC) tem sido crescente dada a segurança e eficácia demonstradas em algumas formulações. Nesse contexto, a vacinologia reversa permite a identificação de alvos imunogênicos diretamente a partir do genoma de patógenos, aliando ferramentas de bioinformática e biologia molecular. Entre os genes preditos com potencial antigênico, o ykuE de Corynebacterium pseudotuberculosis codifica uma metalofosfoesterase dependente de manganês e zinco, envolvida em reações de hidrólise e participante da via de translocação Tat (twin-arginine translocation), responsável pelo transporte de proteínas enoveladas e essencial para a sobrevivência bacteriana. Estudos in silico apontaram o gene ykuE como um potencial alvo vacinal contra a LC. Assim, o objetivo foi construir o plasmídeo recombinante pAE/ykuE, etapa inicial para a expressão e posterior avaliação da proteína YkuE quanto ao seu potencial antigênico. Para isso, a cepa 1002 de C. pseudotuberculosis foi cultivada em meio Brain Heart Infusion (BHI) suplementado com 0,5% de Tween 80 a 37 °C sob agitação de 150 rpm por 24 h, e o DNA genômico foi extraído utilizando o kit comercial PureLink™ Genomic DNA Mini Kit. A amplificação do gene ykuE foi realizada por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) utilizando aproximadamente 50 ng de DNA genômico, 10 μM de cada primer (forward 5’-AATCCATGGAATGGTTGTTAAGCC-3’ e reverse 5’-AATAAGCTTTTAACGCTCGGTGAC-3’) e PCR Master Mix (2×) (Thermo Fisher Scientific®) em volume final de 50 μL. O fragmento amplificado e o vetor pAE foram digeridos com as enzimas de restrição NcoI e HindIII (Thermo Fisher Scientific®), purificados e ligados na presença da enzima T4 DNA ligase (Thermo Fisher Scientific®). O produto da ligação foi utilizado para transfectar Escherichia coli TOP10 por eletroporação a 1,8 kV. Após incubação em meio Luria-Bertani (LB) suplementado com ampicilina (100 µg/mL) a 37 °C por 16 h, as colônias obtidas foram submetidas a triagem por extração rápida de DNA com Fenol:Clorofórmio:Álcool Isoamílico (25:24:1) (Êxodo Científica®) e eletroforese em gel de agarose. As colônias que apresentaram bandas com tamanho maior que o plasmídeo pAE foram selecionadas para extração de plasmídeo usando o GenElute™ Plasmid Miniprep Kit (Sigma-Aldrich®). A presença do inserto de interesse foi confirmada por digestão enzimática e liberação do inserto nos plasmídeos recombinantes. A análise em gel de agarose 0,8% confirmou a amplificação de um fragmento de aproximadamente 958 pb, compatível com o tamanho dos amplicons esperados. Na triagem screening foi possível observar bandas com tamanhos superiores ao pAE (2822 pb), sugerindo a presença de colônias recombinantes. Em tais plasmídeos, confirmou-se a clonagem do gene ykuE no vetor pAE através de digestão enzimática com liberação de inserto no tamanho de PCR dos plasmídeos extraídos, pela visualização das bandas do gene ykuE com tamanho de 958 pb em gel de agarose. Em conclusão, a construção do plasmídeo pAE/ykuE foi exitosa e representa um avanço significativo para as etapas subsequentes de expressão e purificação da proteína YkuE recombinante com vistas a obtenção de nova formulação vacinal contra C. pseudotuberculosis.