Clonagem de novo gene como estratégia imunoprofilática no combate à Linfadenite Caseosa
Augusto César Silva Ribeiro
UFERSA
Lenise Maria Parente Mota
Ana Karolina Melo Oliveira Barros
Bárbara Monique de Freitas Vasconcelos
Francisco Silvestre Brilhante Bezerra
Palavras-chave: clonagem molecular, vacina recombinante, mtrB
Resumo
O gene mtrB codifica uma cinase sensora de histidina pertencente ao sistema regulatório de dois componentes, o MtrAB. A inativação do gene mtrB em Mycobacterium pseudotuberculosis resultou em redução da sua sobrevivência em macrófagos e aumentou sua associação com autofagossomas e autolisossomas, demonstrando que este é um fator de virulência essencial à sobrevivência no hospedeiro (Banerjee et al., J Biol Chem., 294(52):19862-19876, 2019). Em Corynebacterium pseudotuberculosis, o gene mtrB se destacou como um dos antígenos mais promissores a partir de um workslow integrado in silico para prospecção de novos alvos vacinais através da análise de genes compartilihados no genoma core de 65 cepas de C. pseudotuberculosis (Araújo et al., Gene, 702:36-45, 2019). Assim, o presente trabalho objetivou clonar o gene mtrB em vetor pAE, visando a expressão a posteriori deste antígeno vacinal. O DNA genômico da cepa 1002 de C. pseudotuberculosis foi extraído utilizando o PureLink® Genomic DNA Mini Kit (ThermoFisher®). O Programa Vector NTI Advance 11 (Invitrogen, Waltham, MA, EUA) foi utilizado para realizar a montagem da molécula recombinante pAE/mtrB, desenho dos primers e seleção de enzimas de restrição. A cepa 1002 de C. pseudotuberculosis foi cultivada e o pellet bacteriano foi utilizado para a extração do DNA genômico com o kit PureLink™ Genomic DNA Mini Kit®. A amplificação do gene mtrB (Gene ID: 69458734) foi realizada através de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), em gradiente de temperatura entre 51 e 61ºC (Tm média = 56ºC), visando o teste da temperatura ideal de anelamento, com o uso de 50 ng do DNA genômico, 10 μM de cada primer (forward 5’AAGGATCCATCAATACCAAGTTGG3’ e reverse 5’AAGAATTCCTAGCCATTCTGCTTC3’) e PCR Master Mix (2x) (ThermoFisher Scientific®) em um volume final de 50 μl. Os produtos de PCR foram visualizados em gel de agarose a 0,8%, utilizando como agente intercalante o corante Blue Green (LCG Biotecnologia®), sob luz UV. Os amplicons e o pAE foram submetidos à digestão enzimática utilizando as enzimas de restrição FastDigest® EcoRI e HindIII (ThermoFisher®), seguidos pela ligação com T4 DNA ligase (ThermoFisher®). Em seguida, o produto da ligação foi utilizado na eletroporação em Escherichia coli TOP 10. Posteriormente, o screening das possíveis colônias recombinantes foi realizado por lise e extração rápida de DNA com fenol-clorofórmio (v/v) e análise em gel de agarose 0,8% sob luz UV. A caracterização dos clones recombinantes foi realizada através digestão com as enzimas de restrição EcoRI e HindIII. A PCR em gradiente de temperatura demonstrou que a temperatura de 51 °C apresentou a melhor eficiência de amplificação, através da visualização de banda mais intensa com tamanho de 1543 pb. Entretanto, não foi possível identificar clones recombinantes contendo o plasmídeo pAE/mtrB. Essa limitação pode estar relacionada à ausência de inserção do gene mtrB no vetor, ao crescimento de colônias falso-positivas contendo o vetor religado ou mesmo a falhas nas reações enzimáticas. Estudos futuros visando otimizar as etapas de digestão e ligação ou mesmo a síntese comercial do plasmídeo pAE/mtrB podem ser uma alternativa para a viabilização de formulações vacinais e testes pré-clínicos este antígeno.